Ученые LIFT — среди создателей нового типа клеточного биосенсора пероксида водорода HyPerFLEX

Ученые LIFT совместно с исследователями из Пироговcкого университета, ФЦМН ФМБА России, ИБХ  РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова, а также коллегами из Бельгии создали принципиально новый тип клеточного биосенсора пероксида водорода с возможностью выбора цвета флуоресценции — флуорогенный сенсор HyPerFLEX. Научное исследование опубликовано в журнале Nature Chemical Biology. 

Пероксид водорода (H₂O₂) — одна из важнейших активных форм кислорода в организме. В небольших количествах H₂O₂ взаимодействует с определенными белками и запускает разнообразные клеточные сигнальные процессы. Эти белки управляют дифференцировкой клеток, их делением, воспалением, иммунными реакциями, старением и образованием опухолей, а также реакцией на недостаток кислорода, стресс и программируемую гибель клеток (апоптоз). 

При этом отследить образование и движение пероксида водорода внутри клетки крайне сложно. Поэтому важно понимать, где и когда он образуется и как распространяется. Обычно для наблюдения за молекулами внутри клеток используют белковые биосенсоры, которые способны флуоресцировать, светиться, при взаимодействии с исследуемыми веществами.

Что такое HyPerFLEX?

HyPerFLEX — генетически кодируемый биосенсор пероксида водорода. Он состоит из чувствительного к пероксиду белка OxyR бактерии Neisseria meningitidis и белка Y-FAST, который не способен флуоресцировать сам, но может связываться с маленькими светящимися синтетическими молекулами — флуорогенами, что отличает его от подобных ему биосенсоров.  Важно отметить, что благодаря этой особенности у ученых появляется возможность использовать флуорогены разных цветов — в зависимости от цели эксперимента и желании комбинировать их с другими сенсорами. 

В экспериментах исследователи обнаружили, что HyPerFLEX может обнаруживать еще меньшие количества пероксида водорода в цитоплазме, ядре и митохондриях по сравнению с самым чувствительным белком семейства сенсоров пероксида HyPer7. HyPerFLEX стал первым сенсором, который позволяет наблюдать пероксид водорода даже в люмене эндоплазматического ретикулума — внутреннем пространстве органеллы, где окислительные процессы особенно сильны.

В отличие от существующих сенсоров, HyPerFLEX не требует кислорода для созревания флуорогена, что позволяет использовать его в условиях длительной гипоксии или в анаэробных организмах. Сенсор можно использовать для мультифотонной микроскопии, что позволяет наблюдать сигналы пероксида водорода глубоко внутри тканей — например, на срезах мозга мыши на глубине до нескольких сотен микрометров, что делает возможным изучение клеток прямо в живой ткани.

Зачем нужен HyPerFLEX?

Сенсор HyPerFLEX позволяет отслеживать, где и когда в живых клетках появляются и действуют молекулы пероксида водорода на уровне клеточных компартментов (в ядре, эндоплазматическом ретикулуме, матриксе митохондрий, цитозоле). Кроме того, биосенсор способен менять цвет свечения — от зеленого до красного — в зависимости от задач эксперимента. Сочетание этих преимуществ открывает возможность с высокой точностью наблюдать за химическими реакциями внутри клеток.

При больших концентрациях пероксид водорода перестает действовать избирательно. Он неспецифически окисляет белки, жиры и другие молекулы, повреждая их и вызывая окислительный стресс. Считается, что именно окислительный стресс лежит в основе многих нейродегенеративных заболеваний. Полученный биосенсор позволит выявить роль пероксида водорода в разнообразных клеточных процессах и поможет в поиске новых способов диагностики и лечения заболеваний.

«Принцип создания флуорогенных биосенсоров, разработанный в исследовании, позволит конструировать новые сенсоры разнообразных метаболитов и сигнальных молекул для использования в живых клетках на уровне как отдельных клеточных компартментов и субкомпартментов, так и целой ткани или органа. В дальнейшем мы планируем расширить панель флуорогенов с тем, чтобы появилась возможность наблюдать за динамическими сигнальными и патологическими процессами в клетках с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения, так как многие молекулярные события в клетке реализуются на нанометровой шкале. Кроме того, необходимо подобрать флуорогены, которые при системном введении в кровоток животных будут легко преодолевать гемато-энцефалический барьер, что позволит изучать редокс-метаболизм мозга в свободноподвижных животных», — рассказывает руководитель проекта, поддержанного грантом РНФ, Всеволод Белоусов, член-корреспондент РАН, директор Федерального центра мозга и нейротехнологий ФМБА России, заведующий лаборатории Синтетических нейротехнологий Пироговского Университета. 

«Биоткани обладают сильным рассеянием, поэтому классические техники визуализации флуоресцентных маркеров в живых животных практически не работают. Разрабатываемые в нашей лаборатории методики микроскопии при двух- и трехфотонном возбуждении белков позволяют понизить рассеяние возбуждающего света и радикально локализовать флуоресцентный отклик. Нами были исследованы двухфотонные спектры возбуждения сенсора HyPerFLEX с различными флуорогенами для их оптимального многофотонного возбуждения. Было показано, что высокая яркость сенсоров HyPerFLEX с красными флуорогенами позволяет следить за динамикой пероксида водорода в нейронах живого мозга мыши на глубинах до 300 мкм» — прокомментировал соавтор исследования старший научный сотрудник кафедры общей физики и волновых процессов Физического факультета МГУ им. Ломоносова Ланин Александр.

Результаты исследования, поддержаны грантом Российского научного фонда (РНФ).